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黃曲霉毒素(B1,B2,G1,G2)的高效液相色譜HPLC檢測(cè)方案

【黃曲霉毒素】

黃曲霉毒素是主要由黃曲霉 (aspergillus flavus)寄生曲霉 (a.parasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的機(jī)率最高。B1 、B2和G1、G2,就是經(jīng)常經(jīng)常出現(xiàn)在農(nóng)產(chǎn)品中的黃曲霉毒素的代表,毒性最強(qiáng)的排行“B1”,B表示藍(lán)色,因?yàn)樗谧贤夤獾恼丈湎聲?huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。除了親兄弟B2之外,它還有堂兄弟G1和G2,因?yàn)樵谧贤夤庀掳l(fā)射黃綠色熒光而得名。

黃曲霉毒素在農(nóng)產(chǎn)品中幾乎無(wú)法避免,不想餓死的人類也只好無(wú)奈地吃下一些。世界各國(guó),都只能設(shè)定一個(gè)“限量標(biāo)準(zhǔn)”。不超過(guò)那個(gè)標(biāo)準(zhǔn),危害就小到可以忽略了。它們存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中,特別是容易污染花生、玉米、稻米、大豆、小麥等糧油產(chǎn)品,當(dāng)人攝入量大時(shí),可發(fā)生急性中毒,出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。當(dāng)微量持續(xù)攝入,可造成慢性中毒,生長(zhǎng)障礙,引起纖維性病變,致使纖維組織增生。AFT的致癌力也居首位,是目前已知最強(qiáng)致癌物之一。

由于黃曲霉毒素在水溶液中會(huì)發(fā)生熒光淬滅,反相色譜中B1和G1兩種異構(gòu)體熒光強(qiáng)度很弱,需要進(jìn)行衍生化。衍生化的方法一般有柱前和柱后兩類,我國(guó)藥典在測(cè)定黃曲霉毒素時(shí)采用碘柱后衍生法。


【樣品處理過(guò)程】

中藥:取供試品粉末15g(過(guò)二號(hào)篩),精密稱定,加入氯化鈉3g,置于均質(zhì)瓶中,精密加入70%甲醇溶液75ml,高速攪拌2min(攪拌速度大于11000r/min),離心5min(離心速度大于2500r/min),精密量取上清液15ml,置50ml量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻,用微孔濾膜(0.45um)濾過(guò),量取續(xù)濾液20ml,待凈化;

大米:取樣品25g,加入5g氯化鈉與125ml提取液(70%甲醇-水溶液)混勻,劇烈振蕩20min,用快速定性濾紙過(guò)濾,收集濾液;取10ml濾液加入20ml蒸餾水稀釋,過(guò)濾,收集濾液作為上樣液,取15ml該溶液待凈化;

植物油:取樣品25g,加入125ml提取液(80%乙腈-水溶液)混勻,劇烈振蕩20min,用快速定性濾紙過(guò)濾,收集濾液;取10ml濾液加入40ml蒸餾水稀釋,過(guò)濾,收集濾液作為上樣液,取25ml該溶液待凈化;

凈化過(guò)程需用到黃曲霉免疫親和柱,凈化過(guò)程略。


【色譜條件】

色譜柱:C18, 4.6 mm*250 mm,粒度5 μm

流動(dòng)相:甲醇-乙腈-水=40:18:42

流動(dòng)相B:將2.2g一水庚烷磺酸鈉與6.8g磷酸二氫鉀溶于500ml水中,與500ml甲醇混合,PH=3.5;兩相混合梯度脫洗;

波長(zhǎng):λex=360nm     λem=450nm 

流速:0.8 mL/min

衍生溶液為0.05%的碘溶液,衍生泵:0.3ml/min, 衍生溫度:70℃


【譜圖】


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【儀器配置】


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